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由香港大學（港大）理學院分子及細胞生物學研究部副教授閆愛新博士帶領的研究團隊，聯合港大李嘉誠醫學院微生物學系名譽臨床教授胡釗逸共同進行的研究，開發了一個可轉移和整合、基於 I 型 CRISPR-Cas 的基因編輯技術。該技術可以高效編輯超級細菌銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）， 並加速鑒定多重耐藥 (MDR) 病原體耐藥決定因素和開發新型抗耐藥的策略。銅綠假單胞菌是一種廣泛存在的超級細菌，可以感染多個器官和組織，並且是造成院內感染的主要病原體。該研究不僅為 「非模式」細菌（例如直接從臨床和環境分離的和形成人類微生物組的細菌）建立基因組編輯技術開闢了一條新途徑，亦為擴展新型CRISPR-Cas技術提供框架。該研究現已於國際領先的科學期刊《核酸研究》（Nucleic Acids Research）發表。

研究背景
CRISPR-Cas 是原核生物中的適應性免疫系統，它通過切割病毒的 DNA 來解除入侵病毒的威脅。由於其獨特的靶向和改變 DNA 序列的能力，CRISPR-Cas 被用作下一代基因組編輯方法；其中基於 2 類 II 型 的CRISPR/Cas9 系統的基因組編輯方法，徹底改變了大量模式生物的遺傳操作方法而獲得了 2020 年諾貝爾化學獎。然而，2 類 II 型的CRISPR-Cas 系統僅佔原核生物中自然編碼的 CRISPR-Cas 系統的約 10%，它們在編輯細菌基因組方面的應用相當有限。

隨着測序技術和生物信息學的發展，屬於不同類別和類型的 CRISPR-Cas新亞型不斷被鑒定，它們是擴展基於 CRISPR 技術的原料庫。其中，自然界中分佈最廣和最多樣化的 CRISPR-Cas 系統是 1 類I 型系統，佔已鑒定的所有 CRISPR-Cas 系統的 50%，並且具有 2 類CRISPR-Cas系統無法具備的獨特優勢，比如極低的脫靶效應、可以實現大片段DNA移除等。然而，I 型 CRISPR-Cas 系統依賴於稱為 Cascade 的多組分效應複合物來干擾 DNA，這類複合物不易轉移到異源宿主，限制了這些天然豐富的 CRISPR 系統在基因組編輯和疾病治療中的廣泛應用。

主要發現
在此之前，該團隊在從瑪麗醫院一個血流感染病例中分離的一株耐多藥銅綠假單胞菌PA154197中，鑒定出一個高活性的I-F型CRISPR-Cas系統。團隊為CRISPR-Cas 系統進行分析，並在其基礎之上，成功開發了一種基於內源性 I-F CRISPR-Cas 系統、適用於 PA154197分離株的基因組編輯方法。該方法能夠加快鑒定出臨床分離的耐多藥銅綠假單胞菌中的耐藥性決定因素，和加速開發新的抗耐藥策略的步伐(Cell Reports, 2019, 29, 1707-1717)。

為了克服將複雜的 I-F 型 Cascade 轉移到異源宿主的障礙，團隊將整個 I-F 型 Cas 操縱子（Operon）複製到高效整合型載體 mini-CTX 中，並通過細菌間「接合」的方法，一種自然界微生物常用的 DNA 轉移方法，將複合物傳遞到異源宿主基因組中保守的 attB 基因位點上，從而使它們擁有可以穩定表達和發揮功能的「內源性」 I-F 型CRISPR-Cas 系統。研究表明，與可轉移 Cas9 系統相比，可轉移I-F型 Cascade 顯示出更強的 DNA 干擾能力和更高的穩定性，可在耐藥銅綠假單胞菌中實現高效 (>80%) 和簡便的基因組編輯，即通過一步轉化單個質粒實現基因編輯。

在此基礎之上，他們還開發了一種更先進的可轉移系統。該系統既包括高活性型 I-F 系統，又同時包括了一個重組酶，因而可以在同源重組能力差的菌株、沒有基因組序列信息的野生銅綠假單胞菌分離株，以及其他假單胞菌中實現一步法的基因編輯。最後，引入的 I-F 級聯基因可以通過 I-F 級聯介導的大 DNA 片段刪除法從宿主基因組中輕鬆去除，從而在宿主細胞中進行無疤痕基因組編輯。此外，研究團隊還展示了可轉移系統在基因抑制中的應用，顯示了可轉移 I-F CRISPR 系統的強大和多樣化的應用。

閆愛新博士表示，希望可運用此技術編輯病原菌，還可以改造益生菌，進而為治療耐藥菌引起的感染和促進人類健康發揮巨大作用：「運用此技術研發出的科技和醫療方法，為對抗超級病菌帶來新希望。」

有關研究團隊
本研究由港大理學院生物科學學院及分子及細胞生物學研究部副教授閆愛新帶領，華南農業大學徐澤淩博士為第一作者（曾為港大理學院生物科學學院及分子及細胞生物學研究部博士後研究員）。其他研究人員包括港大李嘉誠醫學院微生物學系名譽臨床教授胡釗逸教授和曹慧犖博士、曲阜師範大學副教授司美茹，及港大理學院生物科學學院及分子及細胞生物學研究部博士生李嫣然和張光明。

研究由香港研究資助局和香港特別行政區食物及衞生局醫療衞生研究基金及香港大學基礎研究種子基金資助。

有關閆愛新研究小組的相關資料：http://www.hku.hk/biosch/staff/ay/index.html
論文連結 ：https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkab521/6307906

相片下載：https://www.scifac.hku.hk/press

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