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香港大學李嘉誠醫學院（港大醫學院）生物醫學學院研究團隊成功研發出源自金黃葡萄球菌的Cas9（SaCas9）核酸酶的新型蛋白變體，命名為 KKH-SaCas9-SAV1 和 SAV2。相對於原型的SaCas9，SAV1和SAV2的目標準確度大大提升，能僅針對致病的等位基因進行編輯而不影響健康的等位基因；並可將SaCas9常見的脫靶效應減少超過95％，同時保持高度編輯能力。這項研究為因單鹼基突變而引起的疾病開闢了新的治療方向。相關研究成果現已在國際科學期刊《Nucleic Acids Research》（按此瀏覽期刊文章），按此結果而作的專利申請亦已提交。

研究背景
研發新型的基因編輯工具，能夠有助醫治更多遺傳疾病，為病人帶來新曙光。CRISPR-Cas9是一種能夠編輯活細胞中指定的脫氧核醣核酸（DNA）片段的強大工具，而將CRISPR-Cas9應用於醫治帶有單鹼基突變疾病的需求一直相當大；然而現有的Cas9核酸酶在區分只有單鹼基突變的等位基因和正常等位基因的能力十分有限。在這項研究中，研究團隊成功擴展Cas9的適用範圍，能夠針對可致病的單鹼基突變（或單核苷酸多態性single-nucleotide polymorphisms (SNPs)），精確地辨別和剪輯病變基因，而健康的基因則不受影響（圖1）。

在眾多的CRISPR-Cas9工具中選擇合適的基因編輯酶，考慮的主要因素包括：導入細胞的難易程度、目標範圍的大小、編輯效率及其準確度。由於KKH-SaCas9比常用的SpCas9細小，適合利用腺相關病毒作為載體，於基因治療中導入細胞，團隊因此集中改良KKH-SaCas9核酸酶。相比原型SaCas9，擁有KKH變異的SaCas9，其間隔序列前體臨近基序（protospacer adjacent motif，PAM）的相容性更高，可應用於更多基因座。

研究成果
雖然準確度高、針對基因組序列的原型SaCas9蛋白變體早經研發，但研究團隊發現這些變體上的胺基酸變異與目標範圍更廣泛的KKH-SaCas9變體並不兼容。根據早前的研究¹，組合多個胺基酸變異能提高SpCas9核酸酶的準確度和效率，故而在此基礎上透過析解蛋白結構來進行胺基酸突變，然後篩選變體，確定了其中兩個，即KKH-SaCas9-SAV1 和 SAV2，其精準度比其他變體優勝。具體來說，KKH-SaCas9-SAV2減少了超過95%在編輯人體細胞DNA上的脫靶現象，同時保留了超過80%原型SaCas9的編輯能力。展望未來，研究團隊將繼續提高該核酸酶的編輯能力，並使其能夠用於編輯以外的變異修正。

更重要的是，研究團隊進一步發現了KKH-SaCas9-SAV1 和 SAV2區分單䶨基變異目標，包括遠離PAM位置者的獨特功能。這項發現可以將基因編輯的範圍擴大到許多以前無法重點治療的單一突變及與SNP相關的疾病，同時避免在編輯過程中影響與之高度相似的健康等位基因。此外，透過其他 SaCas9 變體，有限度的SNP或單一突變只能限制在sgRNA 種子區域內；而這項限制也局限了以往可治療的基因疾病範圍。

研究意義
領導研究的港大醫學院生物醫學學院助理教授黃兆麟博士表示：「我們研發的新型KKH-SaCas9是一種十分重要的核酸酶，可應用於精確地編輯生物醫學治療目標及體內基因編輯等方面。這可能使基因編輯應用於治療更多遺傳疾病時更為安全。」

研究團隊
是項研究由港大醫學院生物醫學學院系助理教授黃兆麟博士領導。共同第一作者為港大醫學院生物醫學學院博士生袁紫璐小姐、助理研究員Dawn Thean Gek-lian小姐、博士生陳迦靜小姐、博士後研究員周鵬博士、及助理研究員郭翠珊小姐，並得到博士後研究員褚愷宜博士、技術員張秀霞小姐、博士生王貝小姐和博士後研究員蔡正姿博士的協助。其他合作研究人員包括：港大醫學院內科學系梁如鴻教授，及劉鳴煒復修醫學中心的鄭宗立助理教授團隊。

鳴謝
此項研究得到香港特別行政區創新科技署Health@InnoHK創新平台腫瘤及免疫學研究中心、香港研究資助局(TRS-T12-702/20-N)、國家優秀青年科學基金項目（32022089）及劉鳴煒復修醫學中心資助。

傳媒查詢
請聯絡香港大學李嘉誠醫學院（電郵︰medmedia@hku.hk）。

¹ Choi G.C.G., et al. Combinatorial mutagenesis en masse optimizes the genome editing activities of SpCas9. Nature Methods 16, 722-730 (2019)